70-летняя Алла Пугачева опубликовала селфи, на котором ее невозможно узнать
18:35, 13.01.2020
Примадонна поздравила своих поклонников со Старым Новым годом.
70-летняя Алла Пугачева за последние несколько лет заметно похудела и посвежела. Примадонна регулярно выходит в свет в нарядах, подчеркивающих ее фигуру. Не упускает она и возможности сверкнуть стройными ногами в мини. Как известно, у певицы есть свой диетолог, который тщательно следит за ее рационом. Именно при помощи специалиста Алла Борисовна смогла избавиться от 20 лишних килограммов.
Ни для кого не секрет, что в погоне за вечной молодостью Алла Пугачева периодически прибегает к услугам пластических хирургов. Впервые Примадонна решилась на операцию по трансформации внешности еще в начале 90-х. Толчком для этого стало знакомство певицы, которой тогда было за сорок, с 29-летним начинающим музыкантом Сергеем Челобановым. Между Аллой Борисовной и ее новым фаворитом вспыхнул бурный роман и, чтобы на фоне молодого избранника выглядеть так же эффектно, звезда решилась лечь под нож хирурга. Операция прошла неудачно и, более того, из-за занесенной инфекции Пугачева едва не лишилась жизни.
Несмотря на пережитое, Алла Борисовна продолжила эксперименты с внешностью. Поговаривают, что недавно 70-летняя звезда вновь легла под нож хирурга. Невозможно не заметить, как преобразилось лицо певицы. Как отметили многие интернет-пользователи, Пугачева все больше становится похожа на свою подругу Лайму Вайкуле. Так, сегодня Примадонна опубликовала селфи, на котором ее невозможно узнать. «Встречайте Старый Новый Год с хорошим настроением и все Старое обновится», — написала знаменитость (орофграфия и пунктуация автора даны без изменений. — Прим.ред.).
70-летняя Алла Пугачева опубликовала селфи, на котором ее невозможно узнать
Несмотря на то, что в свои 70 лет Алла Пугачева очевидно хорошо выглядит, есть хейтеры, которые, по ее словам, критикуют Примадонну «за старость». Об этом певица накануне своего юбилея поведала в откровенной беседе с художественным руководителем Театра имени Ермоловой Олегом Меньшиковым. Для Аллы Борисовны это стало первым большим интервью за последние 10 лет.
«Да, я старая. И ничего с этим я поделать не могу. И говорить о том, что у меня душа молодая, я тоже не буду. Да, я старею. Уже ложишься и думаешь: «Проснуться бы». Встаешь — думаешь: «Так, надо посидеть, чтобы голова не закружилась, вдруг упадешь еще». Вчера на Дальнем Востоке были. Я уже не помню, когда в последний раз вино пила. Подумала, дай-ка, выпью. И таблетку заодно. Есть свои прелести, короче говоря. Над ними не надо смеяться, это само по себе смешно», — заявила звезда.
По признанию самой Примадонны, держать себя в тонусе ей помогают молодой муж Максим Галкин и 6-летние дети — Елизавета и Гарри. Напомним, что певица и шоумен, разница в возрасте между которыми составляет 27 лет, официально узаконили свои отношения в 2011 году, когда их союзу исполнилось уже 10 лет. Через два года суррогатная мать родила супругам близнецов. В 2018-м, после шести лет брака, Пугачева и Галкин обвенчались.
Максим Галкин и Алла Пугачева с детьми Лизой и Гарри
Читайте также:
Алла Пугачева показала, как ее дети поют в караоке песню «Миллион алых роз»
Максим Галкин показал, как их с Аллой Пугачевой дети подпевают песне Примадонны
Максим Галкин показал, как Алла Пугачева вместе с детьми встречает его с гастролей и прыгает от радости
Похудевшая Пугачева красиво позировала в купальнике, показав секси-бедра. Фото
Анна Адамайтес Звезду запечатлел муж во время отдыха в Латвии.Алла Пугачева. Фото: instagram.com/alla_orfey/Каждое лето Алла Пугачева и Максим Галкин отдыхают в Юрмале, комфортный климат Прибалтики, а также приятная компания Лаймы Вайкуле решают важную роль при выборе направления отдыха. Однако лето 2020-го внесло свои коррективы для многих россиян.
Ароматные и нежные: Высоцкая рассказала, как быстро приготовить пончики на кефире с корицейТакая выпечка порадует и взрослых, и детей.Примадонна решила не рисковать и осталась в своем поместье в деревне Грязь, на зимних каникулах певица тоже отметилась исключительно у своих приятелей поблизости, навещая только самых близких людей. Тем не менее, ее поклонники сильно соскучились по пляжным фото своей любимицы и нашли в архивах ее снимок в купальнике, которое как-то сделал супруг во время отдыха летом 2019-го года в Латвии. К этому времени звезда заметно похудела, и ее благоверный явно гордился формами своей возлюбленной.
На фото Алла Борисовна предстала в черном купальнике-бандо и женственных босоножках на каблучке, она кокетливо согнула стройную ножку, сильно впечатлив своими изгибами поклонников.
Смотрите также«Очень эротично сфотографировалась!», «Какая фигура! Просто обомлеть!», «Невероятно! И ей за 70? Как так!?», «Ох, мне 40, а живот в два раза больше», «Какие красивые бедра», «Наша королева, неподражаемая Алла, невозможно быть такой красивой и очаровательной», «Слишком красивая! Как повезло Максиму! И мудрая, и привлекательная, да к тому же богатая!» — прокомментировали кадр фолловеры.
Диета Аллы Пугачевой
Как похудела Алла Пугачева
Выяснилось, что по совету Кристины Орбакайте Алла придерживается бессолевой диеты. Пугачева признается, что очень любит все соленое, но отказалась от любимых блюд ради безупречной фигуры.
РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ
Кроме того, Алла Борсовна перестала есть на ночь, полностью исключила из рациона хлеб. Зато стала чаще есть легкие овощные супы, запеченную в фольге рыбу и гречку. Близкие признаются, что звезда предпочитает такой рецепт: гречку нужно с вечера замочить, добавить ложку растительного масла, немного сахара и соли, потом залить кипятком и укутать в полотенце. На следующий день можно устроить разгрузочный день на гречке.
РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ
Еще один секрет похудения — это правильный режим дня. Врачи посоветовали Алле ложиться спать до 23.00. Благодаря этому налаживается обмен веществ, а аппетит заметно снижается, ведь организму не нужно компенсировать недостаток сна при помощи жирной и сладкой пищи.
РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ
Пугачева говорит, что за праздничным столом вполне может позволяет себе любимые блюда, а за компанию с друзьями может съесть и кусок торта. Но после этого непременно устраивает себе разгрузочный день.
Травяная диета Аллы Пугачёвой
За время творческой карьеры Алла Пугачева несколько раз кардинально худела и снова набирала вес. Ей даже приписывают изобретение «трявяной диеты», основа которой — кефирный коктейль. Чтобы его приготовить, нужно 1,5 литра нежирного кефира, свежие огурцы и любая зелень по вкусу. Кефир смешать с порезанной зеленью укропа, петрушки, кинзы, добавить измельченный на терке огурец. Тщательно перемешать и пить в течение дня при появлении чувства голода.
похудевшая Алла Пугачева показала удивительно стройные ноги
instagram.com/maxgalkinru
71-летняя Алла Пугачева в мини-шортах поразила поклонников. Примадонна надела дерзкий наряд на звездную вечеринку.
РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ
Артистка с мужем Максимом Галкиным посетили первое светское мероприятие после карантина. Супруги присоединились к звездным коллегам и пришли на вечеринку по случаю открытия поп-ап-бутика в «Крокус Сити Молле». Прежде чем отправиться зажигать, влюбленные устроили фотосессию дома.
Алла Борисовна в монохромном образе кокетливо позировала рядом с мужем. Артистка выбрала футболку и мини-шорты с колготками. На плечи звезда накинула пальто, а шпилькам предпочла туфли на устойчивом каблуке. Наряд идеально подчеркнул стройную фигуру Примадонны. Певица сделала пышную прическу и макияж с акцентом на глазах.
Максима и Аллу назвали прекрасной парой., instagram.com/maxgalkinru
Однако Примадонна забрала почти все внимание на себя, instagram.com/maxgalkinru
РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ
Поклонники пришли в бурный восторг от похорошевшей Пугачевой. Аллу Борисовну осыпали комплиментами. Многие отметили, что артистка стала выглядеть совсем юной.
«Потрясающая!», «Боже! Алла Борисовна ещё никогда так шикарно не выглядела», «Алла стала выглядеть лучше! А её ногам сейчас и 25-летние позавидуют», «Аллочка — красотка!», «Я хочу так же выглядеть, когда мне будет чуть больше, чем есть сейчас. Какая же всё-таки Алла Борисовна офигенская! Красивая!», «У Аллы фигура 18-летней!», «Звезда, которая никогда не погаснет!» — написали фолловеры.
РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ
Фигура звезды вызвала бурное восхищение, instagram.com/maxgalkinru
На самой вечеринке Алла Борисовна показала, что молода не только внешне, но и душой. Примадонна стала звездой танцпола. Артистка зажигательно двигалась под живое выступление Полины Гагариной и подпевала.
Пугачева собрала все взгляды и едва не затмила коллегу на сцене. В движении фигура звезды казалась еще более хрупкой.
РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ
Артистка с дочерью и сыном растрогала фанатов. Максим запечатлел, как жена мило общается с детьми. Пугачева впервые после окончания карантина показала себя крупным планом. Снимки легендарной певицы вызвали бурную реакцию поклонников. Алла Борисовна решила обновить свой гардероб. Она приняла дерзкую позу в кресле.
Похудевшая Алла Пугачева стала выглядеть на 20 лет моложе
Алла ПугачеваНакануне она приехала в загородный дом модельера Валентина Юдашкина. Вместе с певицей были также Александр Буйнов и продюсер Александр Достман с супругой. Пользователи отметили образ Аллы Борисовны, которая была в модном зеленом наряде в горошек, а также с необычной прической: волосы были подняты наверх, что дало возможность рассмотреть шею и уши звезды.
«Царевна, вам так идет!», «Какая интересная прическа и все равно, что скажут другие», «Главное, что друзья рядом, а вы счастливы», — пишут в социальных сетях.
На фотографии видно, что компания находится в хорошем настроении. Возможно, они обсуждали недавние «похороны» Александра Буйнова: в Сети накануне появилась статья на эту тему. Новость позабавила артиста, который с юмором отнесся к ситуации. «На следующий день после похорон отметили воскрешение у Юдашкина. Дай Бог всем вам здоровья, друзья, подруги мои! А вас хоронили когда-нибудь при жизни?» — пошутил певец.
Алла Пугачева в компании друзейОтметим, что Алла Борисовна последнее время часто экспериментирует с внешностью — недавно певица сильно похудела и теперь может позволить себе носить облегающие наряды, а также надевать модные платья. При этом Примадонна не стесняется показывать себя и без макияжа — 71-летняя звезда нередко публикует снимки без косметики и хвастается внешностью.
не пропуститеПугачева: «Скажите мне: «Аллочка, просто живи»Неделю назад Пугачева также опубликовала фотографию с Валентином Юдашкиным, правда, там певица была с длинными волнистыми волосами – тот образ подписчикам понравился меньше. По мнению большинства, звезде стоило бы «причесаться» или же воспользоваться услугами стилиста.
Алла Борисовна никогда не скрывала, что ложилась под нож пластического хирурга — один раз это чуть не стоило ей жизни, но все обошлось и с тех пор артистка осторожнее относится к любым изменениям во внешности.
Фото: Legion-Media, Instagram
Алла Пугачева: свежие новости и фото 2021
Алла Пугачева: свежие новости и фото 2021 | СПЛЕТНИК Теги- Полное имя:Алла Пугачева (Alla Pugacheva)
- дата рождения: (72 года)
- место рождения:Россия , Москва
- пол:женский
- профессия:певица, актриса, телеведущая
- цвет глаз:серые
- цвет волос:шатенка
Алла Пугачева, коллеги и друзья: Максим Галкин поделился фотоотчетом с празднования своего дня рождения
Алла Пугачева, Настя Ивлеева, Гарик Харламов, Олег Меньшиков и другие отпраздновали день рождения Максима Галкина
Алла Пугачева и Максим Галкин, Яна Рудковская, Филипп Киркоров и другие на дне рождения Кристины Орбакайте
«Сюрприз маме»: Максим Галкин показал, как сын Гарри удивил свою маму Аллу Пугачеву
Христос воскресе: как Наталья Водянова, Елена Летучая, Кристина Асмус, Алла Пугачева и другие звезды отметили Пасху
Алла Пугачева и Максим Галкин, Валерия и другие звезды собрались на дне рождения друга
Женщина, которая не только поет: за что еще мы любим Аллу Пугачеву
Максим Галкин вместе с детьми поздравил Аллу Пугачеву с днем рождения: видео
Алла Пугачева выпустила музыкальный клип к фильму «Чернобыль»
Алла Пугачева и Максим Галкин с детьми на дне рождения дочери Кристины Орбакайте
Алла Пугачева и Максим Галкин, Татьяна Михалкова и другие на дне рождения Вячеслава Зайцева
Алла Пугачева показала, как учит сына играть на фортепиано: видео
Как Татьяна Навка, Алла Пугачева, Светлана Лобода и другие звезды отметили День матери
Алла Пугачева посвятила Максиму Галкину стихотворение и поделилась совместным снимком
Максим Галкин и Алла Пугачева отметили 19-ю годовщину знакомства
Алла Пугачева высказалась о клевете в свой адрес: «Ничто не может омрачить мне моего радужного настроения»
Алла Пугачева поделилась новыми личными снимками и кадрами дочери Лизы
Как Максим Галкин и Алла Пугачева поздравили своих детей с днем рождения: видео
Диета Аллы Пугачевой: Пугачева похудела на 20кг
Ранее мы писали о предположениях друзей певицы Аллы Пугачевой о том, как ей удалось так стремительно похудеть. Реальность оказалась куда более банальной. О феноменальной диете Аллы Пугачевой стало известно в эфире программы «Утро с Украиной» (канал «Украина»).
Все поклонники Аллы Борисовны с удовольствием наблюдают перемены во внешности своей любимицы: Примадонна похудела на 20 килограмм, изменила стиль и стала обладательницей молодежной прически. Вместо черных балахонов звезда теперь носит яркие вещи и даже джинсы. Кстати, от фобии перед яркими цветами ее избавили дети.
Алла Пугачева, снявшая недавно в фильме о себе, призналась, что сидит на специальной диете, которую ей посоветовала дочь, Кристина Орбакайте. По словам Аллы Борисовны, если нужно быстро сбросить пару лишних килограммов, она меняет режим питания и отказывается от любимых пищевых привычек, чтобы сохранить стройную фигуру.
ЧИТАЙ ТАКЖЕ — Помолодевшая Алла Пугачева наслаждается материнством: певица похвасталась поделками детей
Читайте также: Пластика Примадонны: как и почему менялось лицо Аллы Пугачевой
На ночь не кушать, хлеб не есть. Я очень люблю соленое, но пришлось отказаться. Меня Кристина научила. Она очень быстро приходит в форму на бессолевой диете.
Отметим, что Алла Пугачева выглядит сногсшибательно! И кстати, в недавнем интервью Филипп Киркоров, помимо сенсационного признания о том, что он жалеет о разводе с Пугачевой, рассказал, что именно Примадонна мотивировала его похудеть. Филипп Бедросович сбросил, кстати, тоже 20 кг.
Читайте также: Помолодевшая Алла Пугачева наслаждается материнством: певица похвасталась поделками детей
Напомним, что в конце прошлого года Алла Пугачева и Максим Галкин впервые официально показали детей, а теперь радуют публику трогательными фото и видео детей в Инстаграм.
Материалы по теме:
Алла Пугачева удивила помолодевшим лицом
Несмотря на подозрения недоброжелателей в фотошопе, легенда советской и российской эстрады Алла Пугачева продолжает удивлять поклонников своей великолепной внешностью.
Об этом свидетельствует недавнее фото, которое разместила супруга певца Максим Галкин в своем Instagram в пятницу, 10 января, сообщает Хроника.инфо со ссылкой на Факты.
«Семейный поход в кино», — подписал снимок с женой Аллой Пугачевой и ее 6-летними близнецами Гарри и Лизой Максим Галкин хэштегом # семья.
Поклонники остались в восторге от «дружной семьи» и внешнего вида Аллы.
«Молодцы!», «Все эти пушистые, кудрявые-красавицы», «Красавчики», «Красиво!», «И все же, не дай бог каждой женщине выглядеть так же шикарно, как Алла Пугачева, Браво !!!», «Какая красивая и счастливая семья »,« Тысяча слов восхищения »,« Замечательная семья !!! »,« Ух ты! Какая красивая! »,« А мамочка Алия на самом деле открытая! Красота Наш популярный фаворит! «Люблю вас всех! Тысяча слов восхищения »,« Алла Борисовна не стареет, а дети все супер », — пишут поклонники.
На снимке Алла Пугачева демонстрирует новый образ: стильные джинсы, утепленная джинсовка цвета кофе с молоком, яркий маникюр и смелая красная кайма для очков.
Между тем, в более ранних беседах со СМИ Примадонна объяснила, что она умеет применять свой имидж так, что всем было бы ошибкой думать, что она делала пластические операции.
«Кожа у меня хорошая, но несколько лет назад мне нужно было что-то подправить для съемок», — рассказала в интервью «Комсомольской правде» Алла Борисовна.Сразу немного поправим овал лица. Но мне отказали. Врачи сказали, что из-за проблем с сердцем и из-за того, что я курю, они не пойдут на риск. У меня диабет. Так что стареть придется красиво, без пластических операций. Я могу нарисовать это лицо похудевшим, изможденным — и вы решите, что я закончила », — сказала 70-летняя звезда.
Посмотреть этот пост в Instagram
В кино 🍿 # семья
Сообщение, опубликованное Максимом Галкиным (@maxgalkinru) 10 января 2020 года в 6:02 по тихоокеанскому времени
(PDF) Влияние конструкции плазменной горелки на качество резки при прецизионной воздушно-плазменной резке металла
STEEL IN TRANSLATION Vol.50 № 3 2020
ВЛИЯНИЕ КОНСТРУКЦИИ ПЛАЗМЕННОГО РЕЗКИ НА КАЧЕСТВО РЕЗКИ 165
9. Чиеу Куанг Фи, Технико-экономическое обоснование узкоструйной плазменной резки металлов
: Автореф. Sci.
Дисс. СПб, 2008.
10. Лащенко Г.И. Плазменная резка металлов и сплавов
. Киев: Экотех-
технология, 2003.
. 11. Бхувенеш Р., Норизаман М.Х. и Абдул
Манан М.С., Шероховатость поверхности и влияние MRR на ручную плазменную резку
, Междунар. J. Ind.
Manuf. Eng., 2012, т. 6, вып. 2. С. 459–462.
12. Остриков, О.М. Ю., Кузнецова О.С. Влияние режимов плазменной резки
на микроструктуру, микротвердость и качество обработки углеродистых сталей // Вестн.
Гомель. Гос. Тех. Univ. я. P.O. Сухого.2010. 1 (40),
с. 33–38.
13. Гаар Н.П., Рахимьянов А.Х., Локтионов А.А.,
Предотвращение дефектов реза за счет оптимизации траектории для тонкоструйной плазменной резки
// Вестн. Кузбасс. Гос. Тех.
ун-т, 2018, вып. 2. С. 70–75.
14. Дресвин, С.В. , Зверев С.Г. Плазмотроны: конструкция, параметры, технологии. СПб .: С.-Петербург.
Гос. Политех. Univ., 2007.
15. Tendero, C., Tixier, C., Tristant, P., Desmaison, J.,
и Leprince, P., Плазма атмосферного давления: новый вид
, Spectrochim. Acta, Часть B, 2006, т. 61, стр. 2–29.
16. Цао, Х., Ю, Д., Сяо, М., Мяо, Дж., Сян, Ю. и
Яо, Дж., Конструкция и характеристики ламинарной плазменной горелки
для обработки материалов , Plasma Chem. Плазма
Процесс., 2016, т. 36. С. 693–710.
17. Пыкин Ю.А., Анахов С.В., Матушкин А.В.
ПатентРФ 2584367, Бюл.Изобретения.2016. 14.
18. Шалимов М.П., Анахов С.В., Пыкин Ю.А., Матуш-
кин А.В., Матушкина И.Ю. Оценка эффективности газовихревой стабилизации в газовой среде. плазмотрон для резки металла
, Сварка Диагностика, 2018, №2. 2. С. 57–61.
19. Матушкин А.В., Пыкин Ю.А., Анахов С.В.,
Матушкина И.Ю. О повышении эффективности билизации газового вихря ста-
в плазменном резаке для резки металла,
Твердотельный Феном., 2018, т. 284. С. 218–223.
20. Михайлицын С.В., Шекшеев М.А., Аюбашев О.М.,
и др. Плазменная резка низколегированной стали 09Г2С,
Вестн. Магнитогорск. Гос. Тех. Univ. я. Г.И. Носова,
2017, т. 15, нет. 2. С. 48–52.
21. Мостагими Дж. И Булос М.И., Термоплазменные источники
: насколько хорошо они адаптированы для технологических нужд?
Plasma Chem. Плазменный процесс., 2015, т. 35, стр. 421–
436.
22.Варделл А., Моро К., Темелис Нью-Джерси и Ча-
зелас К. Перспективы технологии плазменного напыления,
Plasma Chem. Плазменный процесс., 2015, т. 35, стр. 491–
509.
23. Венкатарамани Н. Промышленные плазменные резаки и устройства
, Curr. Наук, 2002, т. 83, нет. 3. С. 254–262.
Перевод Л. Мосиной
Линейный комплекс сборки убиквитиновой цепи (LUBAC) генерирует гетеротипические убиквитиновые цепи
Существенные изменения:
1) Хотя авторы представляют первую трехмерную реконструкцию LUBAC, вклад этой модели с низким разрешением в это исследование кажется сомнительным.Двухмерные анализы демонстрируют существенную гибкость комплекса, а прогнозы, полученные на основе трехмерной структуры, лишь незначительно соответствуют выбранным прогнозам, показанным на рисунке 2. Если ЭМ-анализы предназначены для поддержки биохимического восстановления активного комплекса LUBAC, то средние значения класса 2D более чем достаточно. На основании двухмерных данных и того факта, что существует множество средних значений класса, которые не резюмируются двухмерными проекциями (и наоборот), очень маловероятно, что очищенный комплекс согласуется с единственной трехмерной структурой.
Мы согласны с рецензентами в том, что средние значения класса 2D указывают на степень гибкости комплекса. Средние значения класса 2D показывают асимметричную серповидную структуру, в которой масса комплекса сосредоточена на обоих концах с более тонкой линкерной областью, которая, как ожидается, будет источником потенциальной структурной гибкости. Таким образом, 3D-модель в нашем первом представлении действительно может представлять собой среднее из нескольких конформеров, которые различаются степенью поворота вокруг центральной линкерной области.Однако средние значения класса 2D не позволяют предположить наличие множества сильно изменчивых структурных конфигураций в комплексе, которые могут поставить под угрозу точность модели при низком разрешении отрицательного окрашивания. Тем не менее, чтобы учесть озабоченность рецензентов, мы дополнительно доработали 3D-модель комплекса и пришли к реконструкции, которая более точно отражает средние значения 2D-класса (новый рисунок 2B). Более того, прогнозы, полученные на основе новой модели, намного лучше соответствуют средним 2D-классам комплекса, чем те, которые были представлены изначально (новый рисунок 2C).Поэтому мы представляем новую доработанную 3D модель как более точную реконструкцию комплекса LUBAC.
Если бы авторы смогли использовать отрицательное окрашивание комплексов, в которых отдельные субъединицы содержали идентифицируемые теги (например, GFP, MBP), для локализации субъединиц и подтверждения кросс-линк-MS, возможно, была бы подходящей трехмерная модель, но в нынешнем виде полезность 3D-плотности кажется спорной.
Мы, безусловно, согласны с авторами обзора в том, что идентификация каталитических С-концов HOIL-1L и HOIP в структуре подтвердит данные сшивания-МС и повысит полезность структуры.Поэтому мы пометили HOIP или HOIL-1L идентифицируемым C-концевым тегом GFP, чтобы локализовать их соответствующие C-концевые области в структуре. Комплексы с GFP-меткой могут быть очищены, а чистота препаратов может быть определена с помощью масс-фотометрических измерений, показывающих точное ожидаемое изменение массы от GFP-метки, как показано на изображении ответа автора 1.
Очистка LUBAC с меткой GFP.
(A) Очистка LUBAC, содержащего HOIP или HOIL-1L с GFP-меткой. (B) Масс-фотометрическое измерение GFP-меченного LUBAC, показывающее сдвиг на 27 кДа в мономерной (250 кДа) и димерной (500 кДа) массе комплекса.
К сожалению, несмотря на качество очистки, мы не смогли надежно идентифицировать тег GFP в полученных средних значениях двухмерных классов или трехмерных реконструкциях, как показано на изображении ответа автора 2.
средних значений класса LUBAC с тегами GFP.
(A) Средние значения класса LUBAC с тегами GFP. (B) Выбранные средние значения класса, которые могут отображать тег GFP.
Мы не смогли определить точную причину отсутствия метки по данным отрицательного окрашивания, но мы полагаем, что это могло быть результатом либо слишком гибкости метки по отношению к LUBAC для визуализации, либо того, что C-концы белков могут не разрешается в нашей модели.Мы ценим ограничения представленной нами модели; тем не менее, мы включили 3D-реконструкцию, поскольку она представляет собой первую 3D-модель комплекса LUBAC, что является важным достижением в этой области.
2) Циркулярный график на Фигуре 3B для представления данных МС-сшивки может быть улучшен путем «взвешивания» количества или достоверности наблюдаемых сшивок, так что внимание привлекается к наиболее важным и очевидным связям, например, с помощью другой линии. ширины, цветовых оттенков или представление нескольких графиков с разными значениями отсечения.
Оценка для каждой сшивки генерируется с помощью используемого программного обеспечения. Однако множественные поперечно-сшитые пептиды были обнаружены для всех нанесенных на график поперечных связей. Следовательно, во всех трех наборах данных есть несколько оценок для всех обнаруженных перекрестных ссылок, попадающих в один и тот же диапазон. Следовательно, было бы невозможно выбрать объективные оценки для графика или сделать четкое визуальное различие на фигуре, учитывая, что оценки лежат в аналогичных диапазонах для всех нанесенных на график сшивок.
Кроме того, попарное представление домена на рис. 3C-E создает впечатление, что один домен (или даже один остаток) перекрестно сшивается почти со всеми частями противоположного белка (прямая линия на графике, содержащая много точек) в нескольких случаях. Это также может выиграть от пороговой обработки или более осторожного описания. Можно ли действительно сделать вывод, что RBR и NZF в HOIP и HOIL-1L образуют каталитический центр, когда серые линкерные области чрезмерно представлены на графике?
Авторы должны обсудить беспорядочное сшивание линкерных областей и может ли это указывать на высокую динамику, которая может быть связана с трудностями в решении структур с лучшим разрешением.
Поскольку рецензенты поднимают важный вопрос, мы попытались улучшить наши данные путем дополнительной очистки LUBAC с помощью стадии гель-фильтрации перед сшивкой. В новых условиях мы не могли наблюдать каких-либо заметных изменений в картине сшивания, как показано на примере парного графика для межбелковых сшивок HOIP-to-HOIL-1L (изображение ответа автора 3).
XL-MS результаты с дополнительной стадией очистки перед сшиванием.
Каждый из трех белков имел по одному остатку, который, как наблюдали, сшивал без разбора со всеми другими доменами, давая начало наблюдаемому паттерну на попарных представлениях. Эти остатки были HOIL-1L K174, SHARPIN K318 и HOIP K454 / 458. Мы утверждаем, что эти остатки, вероятно, обнаруживаются на гибких участках белков, что приводит к высоким уровням перекрестного связывания со всеми доменами в комплексе. Действительно, предсказание складчатого индекса для HOIL-1L показывает, что развернутые области совпадают с этими сильно перекрестно связанными областями (изображение ответа автора 4).Эта проблема, вероятно, еще больше усугубляется димеризацией LUBAC. Следовательно, мы не ожидаем, что все сшивки, образованные этими остатками, будут структурно релевантными. Однако, поскольку они являются продуктом экспериментальной установки, их нельзя отфильтровать во время анализа данных. Следовательно, они были оставлены на рисунках, чтобы представить объективную картину данных. Тем не менее, точность выборочно сшивающих областей, включая NZF и RBR домены HOIL-1L и HOIP, не зависит от фона, создаваемого беспорядочным сшиванием остатков.Мы уверены в своих выводах о каталитическом центре LUBAC, поскольку они подтверждаются нашими биохимическими данными. Как показано на фиг. 7, мутация каталитического Cys HOIP ингибирует каталитическую активность HOIL-1L; аналогично мутация NZF HOIL-1L отменяет его каталитическую активность.
График индекса кратности человеческого HOIL-1L.
Области в HOIL-1L, по которым наблюдается поперечная сшивка, в основном находятся в области с низким индексом складчатости (развернутой) на показанном графике.
Мы понимаем, что наше обсуждение этих беспорядочных перекрестных ссылок могло быть недостаточным, и обновили текст, чтобы отразить озабоченность рецензентов следующим образом:
«Мы обнаружили некоторые сильно сшивающие остатки, которые образовывали сшивки без разбора со всеми субъединицами всех белков. […] Наличие гибких областей на трех компонентах LUBAC может быть связано с трудностями в определении структур полноразмерных HOIP, HOIL-1L и SHARPIN.”
Кроме того, может быть визуально более привлекательно представить серые области, не являющиеся доменами, более тонкой линией, чем известные домены во всех представлениях на рисунках 3A-3E и 6D.
Основываясь на своих результатах сшивания, авторы подчеркивают взаимодействие RBR доменов HOIP и HOIL-1L и предполагают, что LUBAC может иметь единственный каталитический центр. Однако, поскольку обнаружены множественные контакты между доменами LUBAC (рис. 3B-E), авторам необходимо объяснить, почему они сосредоточились именно на этом.Было бы интересно проанализировать влияние E2 или E2 ~ Ub на сшивание.
Благодарим рецензентов за их наблюдение. Мы также благодарим рецензентов за интересные предложения по E2 и E2 с Ub-загрузкой для включения в анализ XL-MS. Из-за высокой сложности перекрестных связей, описанных выше, мы решили не включать E2 в новые эксперименты. Чтобы объяснить, почему мы сосредоточились на этих перекрестных ссылках, мы обновили текст следующим образом:
«Интересно, что мы наблюдали сшивки между доменами HOIL-1L RING1 и HOIP RING1 / LDD, а также между доменами HOIL-1L RING2 и HOIP RING1 / IBR / RING2 / LDD, что может указывать на то, что два фермента пространственно связанные каталитические активности.Кроме того, внутрибелковые сшивки HOIL-1L образовывались между его доменом NZF и его доменами RING1 / IBR / RING2, что может указывать на домен NZF HOIL-1L с неизвестной функцией в каталитическом действии HOIL-1L ».
3) Thr12 и Thr55 были идентифицированы как потенциальные сайты сложноэфирной связи в пределах поли-Ub, но их мутации не отменяли образование полос, чувствительных к гидроксиламину. Авторы должны указать наблюдаемое покрытие убиквитиновой последовательностью в своем эксперименте по масс-спектрометрии и указать, какие области не были охвачены.
У нас было почти полное покрытие последовательности убиквитина в масс-спектрометрических образцах, где Thr 12 и Thr55 были идентифицированы как сайты сложноэфирной связи. Только последние три аминокислоты убиквитина не были обнаружены в их неконъюгированной форме, что ожидается из-за высокой чувствительности С-концевого пептида LRLRGG к триптическому перевариванию. Мы обновили текст, чтобы отразить охват последовательности убиквитина следующим образом:
«МС / МС спектры GG-конъюгированных дипептидов по остаткам Thr12 и Thr55 убиквитина были обнаружены в этих образцах, в которых было полное покрытие аминокислотной последовательности убиквитина 1-73».
На основании этого мы полагаем, что причина, по которой мутации Thr12 и Thr55 в Ub не отменяют образование гидроксиамин-чувствительных полос, заключается в том, что существуют альтернативные сайты убиквитинирования в мутанте Ub Thr12 / Thr55 (например, Ser20, показанном Kelsall et al. др.), которые мы не смогли обнаружить в наших анализах с использованием Ub дикого типа.
4) Авторы предполагают, что ключевой функцией этерификационной активности HOIL-1 является образование гетеротипических цепей. Хотя это может быть так, альтернативная гипотеза о праймирующих субстратах HOIL-1 с сложноэфирно-связанными убиквитинами, которые затем линейно удлиняются посредством HOIP, также кажется одинаково верной, особенно потому, что, как сообщалось, несколько субстратов были модифицированы линейными цепями, но появляется HOIP. быть адаптированным для модификации только субстрата убиквитина.Авторы должны обсудить эту альтернативную гипотезу и почему обе системы могут быть важны.
В качестве дополнительной поддержки субстратов, потенциально являющихся наиболее распространенными сложноэфирно-связанными видами, NEMO-обогащенные линейные цепи из клеток, обработанных TNF, демонстрируют гораздо более выраженный коллапс по сравнению с сложноэфирно-связанными Ub-Ub-связями, полученными в отсутствие субстрата in vitro. Если бы авторы могли добавить рекомбинантный субстрат (например, IRAK1 / 2 или MyD88) в реакцию in vitro, это значительно укрепило бы статью.
Авторы обзора поднимают важный вопрос, касающийся архитектуры гетеротипических цепей убиквитина и лигазы LUBAC, ответственной за убиквитинирование субстрата. Поэтому мы провели реакцию убиквитинирования in vitro, включая модельный субстрат LUBAC NEMO, и подвергли реакции обработке гидроксиламином (рис. 6В). Наши результаты показывают, что большая часть сигнала от убиквитинированного субстрата не зависит от гидроксиламина, что указывает на то, что цепи, конъюгированные с субстратом, разветвлены, но не прикреплены к субстрату через связи сложного оксиэфира.Мы обсудили данные о разветвлении цепи in vivo и in vitro следующим образом:
«Наш анализ разветвления цепей убиквитина, конъюгированных с субстратом, предполагает, что точки разветвления цепи на основе сложного оксиэфира расположены дистально от субстрата. […] Одно из объяснений может заключаться в том, что в клетках присутствуют другие факторы, которые помогают HOIL-1L в процессе разветвления цепи и которые до сих пор остаются неидентифицированными ».
5) Почему на рис. 4B смешанные субъединицы LUBAC могут образовывать линейную цепь, но не разветвленный Ub4, связанный с оксиэфиром? Образуют ли они высокомолекулярный комплекс, который можно обнаружить с помощью гель-фильтрации?
Как предполагают обозреватели, мы считаем, что индивидуально очищенные и смешанные HOIP, HOIL-1L и SHARPIN не обеспечивают адекватную сборку комплекса LUBAC.В результате, хотя авто-ингибирование HOIP высвобождается и линейные цепи могут быть собраны, более каталитически сложное действие HOIL-1L в разветвлении цепи невозможно. Возможно, это является результатом неправильного пространственного расположения RBR-доменов HOIP и HOIL-1L, приводящего к прерыванию работы предлагаемого реле Cys (Рисунок 8). Чтобы подтвердить это утверждение, мы провели масс-фотометрические измерения для индивидуально очищенных компонентов LUBAC, смешанных в эквимолярном соотношении трех компонентов, как это было сделано для сравнительного анализа in vitro (новый дополнительный рисунок 5).В соответствии с нашей гипотезой мы не наблюдали ни пика 220 кДа, соответствующего собранному LUBAC, ни пика 440 кДа, соответствующего димеризованному LUBAC, что указывает на то, что смешанные компоненты LUBAC не могут адекватно собрать комплекс LUBAC.
6) На фиг. 4E и 5A интересно, что Сезанн и vOTU могли расщеплять сложноэфирно-связанный разветвленный Ub4, хотя молекулярные основания для этих реакций остаются неясными. Расщепляются ли созданные LUBAC, чувствительные к гидроксиламину His-Ub3 и Ub2, показанные на фиг. 5B, под действием Сезанна и vOTU?
Рецензенты задают интересный вопрос относительно способности DUBs Cezanne и vOTU расщеплять небольшие полимеры убиквитина, собранные исключительно с помощью кислородно-эфирных связей.Как и предполагалось, мы провели эксперимент UbiCRest с LUBAC-собранными полимерами His6-убиквитина. Наши результаты показывают, что короткие полимеры убиквитина, связанные с оксиэфиром, действительно чувствительны к расщеплению обоими тестируемыми DUB (новый дополнительный рисунок 6B).
7) Чтобы подтвердить, что остаточные олигомерные виды Ub после обработки OTULIN (рис. 4E) связаны исключительно сложноэфирной связью, следует выполнить последующую стадию обработки гидроксиламином.
Мы провели OTULIN UbiCRest анализ LUBAC-собранных полиубиквитиновых цепей с последующей обработкой гидроксиламином, как предложили составители обзора (дополнительный рисунок 6A, новый).Наши результаты согласуются с полимером убиквитина, содержащим преимущественно связи M1, соединенные с короткими разветвлениями через связи оксиэфира. Оказалось, что большая часть сигнала полиубиквитина чувствительна к расщеплению ОТУЛИНОМ, в то время как небольшой остаток ди- и триубиквитина устойчив к расщеплению ОТУЛИНА, но разрушается при последующей обработке гидроксиламином.
8) Наконец, предположение о том, что в игре может быть задействована Ub-ретрансляция HOIP-HOIL, является захватывающим и подразумевает, что E3-опосредованная Ub-ретрансляция может быть превалирующим процессом.В принципе это должно быть возможно проверить, нарушив связывание E2 с доменом RING1 в HOIL в LUBAC. Стерическая мутация (например, X в Arg) была бы более элегантным подходом, чем координирующая цинк мутация цистеина. Если действует реле, то такой мутировавший LUBAC все еще должен быть способен образовывать сложноэфирные связи.
Мы согласны с рецензентами, что поиск способа ослабить связывание E2 с HOIL-1L было бы отличным способом протестировать предлагаемое реле Cys. К сожалению, хотя мы пытались спланировать такой эксперимент, в настоящее время существует слишком много неизвестных переменных, чтобы позволить создать такой мутант.Основная проблема заключается в точном прогнозировании сайта связывания E2 HOIL-1L. Некоторые доступные структуры других лигаз RBR, таких как HHARI и Parkin, сокристаллизованные с ферментом E2, обнаруживают петлю связывания на домене RING1 (PDB: 5tte, 5udh, 6djw, 6n13). Однако единственная доступная структура HOIP RBR с E2 (PDB: 5edv) показывает второй сайт связывания E2 в доменах RING2 и LDD. Это поднимает вопрос, действительно ли простая мутация RING1 в HOIL-1L предотвращает связывание E2 с помощью HOIL-1L или существует ли дополнительный сайт связывания E2 в домене RING2.Кроме того, мы провели выравнивание множественных последовательностей лигаз семейства RBR и отметили, что объемный гидрофобный остаток не консервативен в HOIL-1L на предполагаемой E2-связывающей петле. Это приводит к возможности того, что если HOIL-1L связывает E2, он может связывать его по-разному с другими лигазами RBR. Следовательно, без структуры RBR HOIL-1L с высоким разрешением вместе с ферментом E2 невозможно надежно получить E2-связывающий мутант HOIL-1L. Невозможность мутации всех правильных остатков может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам и не приведет к правильному обращению к модели.
https://doi.org/10.7554/eLife.60660.sa2| WEPAB097 | Моделирование двухцветного ЛСЭ с широким разделением длин волн и индивидуальной настройкой поляризации | 2808 |
| Лазеры на свободных электронах (ЛСЭ) в настоящее время позволяют проводить передовые исследования в области химии, биологии и физики.Мы используем моделирование для оценки новых возможностей ЛСЭ, которые добавят к впечатляющему репертуару экспериментов, ставшему возможным благодаря этой технологии: двухцветный независимый режим поляризации, который позволяет получать световые импульсы с переменным временным разделением, индивидуально настраиваемой поляризацией и широко разнесенными длинами волн. . Моделирование проводится с использованием широкополосного кода FEL Puffin, результаты которого используются для обсуждения радиационных свойств выходного сигнала. Эта схема применима к существующим и предлагаемым объектам, которые имеют ондуляторы с переменной эллиптичностью и зазором. | WEPIK100 | Применимость сосудов-ондуляторов с NEG-покрытием для испытательного центра CLARA FEL | 3181 |
| CLARA — это испытательный центр FEL в лаборатории Дарсбери (DL), Великобритания. Вакуумная камера ондулятора имеет длину 20 м и внутренний диаметр 6 мм, а ее вакуумные характеристики могут быть улучшены за счет покрытия NEG. Толщина слоя покрытия должна быть тщательно оптимизирована.Слой размером ~ 1 мкм может помочь вакууму, но более тонкий слой будет частично прозрачен для электромагнитного поля, уменьшая резистивные поля следа стенок из-за NEG. Однако очень тонкий слой может не обеспечить необходимых характеристик вакуума. Рассмотрены два типа покрытий НЭГ, получаемых на ДЛ — плотное и столбчатое. Их объемная проводимость была измерена в отдельном исследовании. Сопротивление кильватерного поля резистивной стенки рассчитывалось в соответствии со стандартным подходом для многослойных сосудов. Сгусток электронов 250 фс (среднеквадратичное значение) генерировался в ASTRA, а его кильватерное поле определялось импедансом сосуда.Затем характеристики ЛСЭ были изучены с помощью моделирования GENESIS, и результат был сравнен со случаем без следовых полей. Было обнаружено, что слои НЭГ толщиной более 100 нм приводят к недопустимому снижению мощности ЛСЭ, а вакуумные характеристики таких тонких покрытий неизвестны. Обсуждаются возможные решения этой проблемы. | THPAB053 | Дизайн лазерного нагревателя для испытательного центра CLARA FEL | 3833 |
| Мы представляем рассмотрение исследований микрогруппировки в CLARA (компактный линейный ускоритель для исследований и приложений), предлагаемой испытательной установке ЛСЭ в Великобритании, которая строится в лаборатории Дарсбери.CLARA, линейный ускоритель электронов высокой яркости, дает возможность исследовать нестабильность микрогруппировки. Был предложен ряд теоретических моделей относительно причин этой нестабильности, и она также наблюдалась на различных установках ЛСЭ. Мы применили эти модели к CLARA FEL и предложили подходящую конструкцию лазерного нагревателя, которая обеспечит гибкость с точки зрения диапазона режимов работы для CLARA. Мы также предлагаем метод индукции и контроля нестабильности микрогруппировки с помощью суммирования импульсов фотоинжекторного лазера. | ТУОББ3 | Исследование дизайна HORIZON 2020 EuPRAXIA | 1265 |
| Проект Horizon 2020 EuPRAXIA («Европейский ускоритель исследований плазмы с eXcellence In Applications») направлен на подготовку отчета о проектировании очень компактной и экономичной европейской установки с пучками электронов с несколькими ГэВ, использующими плазму в качестве ускоряющей среды.Ускоритель будет основан на методе ускорения плазмы, управляемой лазером и / или пучком, и будет использоваться для исследований фотонов, испытаний детекторов физики высоких энергий (HEP) и других приложений, таких как компактные источники рентгеновского излучения для медицинской визуализации или обработка материалов. EuPRAXIA стартовала в ноябре 2015 года и представит отчет о проектировании в октябре 2019 года. EuPRAXIA планирует включить в дорожную карту ESFRI в 2020 году. | ТУПИК108 | Исследования центровки на основе луча для испытательного центра CLARA FEL | 1971 |
| Испытательная установка CLARA (компактный линейный ускоритель для исследований и приложений) предназначена для экспериментальной демонстрации инновационных схем ЛСЭ для будущих применений источников света. Такие схемы могут предъявлять строгие требования к свойствам пучка ускорителя, а также к относительной ориентации пучка в излучателях и модуляторах ЛСЭ.Таким образом, выравнивание по лучу (BBA) секции FEL является эксплуатационным требованием для всех современных установок FEL. В этой статье мы демонстрируем результаты моделирования CLARA BBA, а также сообщаем о первоначальных результатах моделирования с использованием нелинейных алгоритмов для непосредственной оптимизации характеристик FEL. | WEPAB089 | Исследование проекта генерации малоцикловых импульсов ЛСЭ с использованием схемы дожигания с синхронизацией режима в Clara | 2783 |
| Работа с ультракороткими импульсами в ЛСЭ является весьма желательной возможностью для получения изображений в сверхбыстрых временных масштабах. В данной статье представлено исследование конструкции для демонстрации принципиальной схемы форсажной камеры с синхронизацией мод (ML-AB) на испытательном стенде FEL CLARA.Моделирование от начала до конца было построено с использованием зависящего от времени трехмерного кода FEL GENESIS 1.3 для оценки эффективности схемы. Прогнозируется способность генерировать импульсы длительностью в несколько фемтосекунд с пиковой мощностью порядка 100 МВт на длине волны 100 нм. Такие импульсы имеют длительность 2 фс (6 оптических циклов), что в ~ 5 раз меньше, чем кооперация FEL. длина. Изучаются возможные пути дальнейшей оптимизации и альтернативные режимы работы. | WEPAB090 | Разработки и моделирование ускорителя испытательного центра CLARA FEL | 2787 |
| Мы представляем последние разработки в конструкции ускорителя CLARA (компактный линейный ускоритель для исследований и приложений), предлагаемого испытательного центра ЛСЭ Великобритании в лаборатории Дарсбери. Требование совместного распространения луча с лазерными затравками с очень разными длинами волн привело к изменению конструкции секции, предшествующей ондуляторам, с заменой изогнутой ноги шиканой.Дополнительные доработки конструкции установки включают межондуляторные секции. Этим завершенным проектом мы показываем начало моделирования ЛСЭ для всех предусмотренных режимов пучка. |
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Форма и сократимость клеток регулируют цилиогенез в клетках с задержкой клеточного цикла | Журнал клеточной биологии
В большинстве клонов выход из клеточного цикла коррелирует с ростом первичной реснички.Мы проанализировали выход из клеточного цикла и цилиогенез в клетках сетчатки человека и обнаружили, что вопреки классической точке зрения не все клетки, выходящие из цикла клеточного деления, генерируют первичные реснички. Используя адгезивные микрорельефы, чтобы контролировать распространение отдельных клеток, мы демонстрируем, что пространственное ограничение клеток является основным регулятором цилиогенеза. Будучи ограниченными в пространстве, клетки собирают сократительную актиновую сеть вдоль своей вентральной поверхности и выступающую сеть вдоль своей дорсальной поверхности. Ось ядро-центросома в замкнутых клетках ориентирована к дорсальной поверхности, где формируются первичные реснички.Напротив, высокораспространенные клетки собирают в основном сократительные актиновые пучки. Ось ядро-центросома распространенных клеток ориентирована к вентральной поверхности, где сократимость предотвращает рост первичных ресничек. Эти результаты показывают, что геометрическое ограничение клеток влияет на клеточную полярность посредством модуляции архитектуры актиновой сети и тем самым регулирует базальное положение тела и рост первичных ресничек.
Развитие и обновление тканей зависят от пространственного и временного регулирования баланса между ростом и покоем клеток.Большинство клеток в тканях находятся в состоянии покоя. У позвоночных эти клетки обычно обладают первичной ресничкой (Gerdes et al., 2009). Широко считается, что цилиогенез тесно связан с клеточным циклом (Wheatley, 1971; Santos and Reiter, 2008). В постмитотических клетках, вступающих в фазу G0, материнская центриоль дифференцируется в базальное тельце, закрепляясь на плазматической мембране и выращивая реснички (Alieva and Vorobjev, 2004). Когда покоящиеся клетки возобновляют клеточный цикл, ресничка резорбируется (Tucker et al., 1979; Пугачева и др., 2007). Согласно этой классической точке зрения, покоящиеся клетки являются реснитчатыми, тогда как клетки без ресничек участвуют в клеточном цикле. Однако несколько примеров дифференцированных, но не реснитчатых клеток in situ подтверждают, что выхода из клеточного цикла может быть недостаточно для индукции цилиогенеза (Seeley and Nachury, 2010). Параметры, регулирующие цилиогенез в клетках с задержкой роста, еще предстоит выяснить.
Из экспериментов на культивируемых клетках был сделан вывод, что остановка клеточного цикла и слияние клеток необходимы для цилиогенеза (Wheatley et al., 1994). Первичные клетки постепенно прекращают цикл после ограниченного числа пассажей, а иммортализованные клеточные линии прекращают цикл после голодания сыворотки и лишения факторов роста. В обоих случаях, кажется, необходим высокий уровень слияния для роста первичной реснички (Alieva and Vorobjev, 2004). Однако, поскольку контактное ингибирование в конфлюэнтных клетках, как известно, вызывает остановку роста клеток, неясно, влияет ли конфлюэнтность на цилиогенез, способствуя покою клеток или играя более прямую роль в цилиогенезе.Мы разработали специальные инструменты и методологию для раздельного контроля степени слияния клеток и выхода из клеточного цикла. Затем мы проанализировали параметры, управляющие цилиогенезом в клетках с остановленным клеточным циклом.
Клетки пигментного эпителия сетчатки человека (RPE1) представляют собой диплоидные иммортализованные клетки, которые поддерживают нормальные контрольные точки для развития клеточного цикла, а также контактное ингибирование роста. Мы подтвердили роль слияния клеток в цилиогенезе в этих клетках, высевая клетки RPE1 с различной плотностью.Затем покровные стекла фиксировали в различные моменты времени после сывороточного голодания и окрашивали на первичные реснички (Alieva et al., 1999). Немногочисленные клетки имели первичные реснички вскоре после голодания. Однако 48 ч спустя большинство сливных клеток имели ресничку, тогда как только небольшая часть диспергированных клеток имела ее (рис. 1А). Мы проверили с помощью видеомикроскопии в течение 48 часов, что большинство клеток действительно перестало делиться при любой плотности. Это продемонстрировало, что клетки могут выйти из цикла с ростом первичной реснички или без него (рис.1 B) и что специфические параметры, связанные с слиянием клеток, по-видимому, регулируют эту судьбу.
Мы далее исследовали роль пространственного ограничения клеток и присутствия межклеточного контакта на цилиогенез путем высевания отдельных клеток на микрорельефные поверхности определенных размеров. Чтобы проанализировать выход из клеточного цикла и цилиогенез в этих условиях, необходимо было определить точное временное окно, в котором клетки могли быть высеяны на микропаттернах и сыворотке не хватало, чтобы получить выход из клеточного цикла перед любым дальнейшим делением.Поэтому мы исследовали клеточный ответ на сывороточное голодание на протяжении всего цикла клеточного деления (рис. 2 А и рис. S1). Как и ожидалось из предыдущих исследований (Pardee, 1974; Zetterberg and Larsson, 1985), большинство клеток, голодных в начале G1, не повторно входят в клеточный цикл (Fig. 2 B). Таким образом, мы поступили следующим образом: клетки были синхронизированы в раннем G1, высевали на отдельные микрорельефы и умерли от голода. Роль ограничения клеток была проверена с использованием набора дискоидальных микрорельефов различного размера от 500 до 3500 мкм 2 (рис.2 С).
Поскольку было показано, что распространение клеток положительно регулирует развитие клеточного цикла (Chen et al., 1997; Huang et al., 1998; Schwartz and Assoian, 2001), мы проверили, действительно ли клетки RPE1 покидают клеточный цикл при всех размерах микропаттерна. Сразу после распространения клетки голодали и контролировали с помощью видеомикроскопа. Клетки на малых или больших микропаттернах покидали клеточный цикл в аналогичных пропорциях (рис. 2, D и E).Контрольные ненасыщенные клетки продолжали делиться. Мы пришли к выводу, что выход из клеточного цикла был специфически индуцирован сывороточным голоданием независимо от степени распространения клеток.
Наблюдались резкие различия в скорости образования ресничек через 48 часов после сывороточного голодания, в зависимости от размера микротекстур. Хотя реснички присутствовали на большинстве клеток, ограниченных небольшими микрорельефами, они становились менее частыми по мере увеличения распространения клеток (рис.3, А и Б). Большинство широко распространенных клеток вышли из клеточного цикла без роста ресничек. Вместо этого в цитоплазме этих клеток обнаружена большая сеть ацетилированных микротрубочек. Кроме того, средняя длина первичных ресничек снижается с 5 до 2 мкм по мере увеличения разрастания клеток (Fig. 3 C). Длинные реснички,> 6 мкм, можно было наблюдать только в пространственно ограниченных клетках. Эти различия присутствовали уже через 24 часа после голодания и сохранялись, по крайней мере, в течение 72 часов (Рис. 3, D и E), предполагая, что они не были вызваны задержкой созревания базального тела (Anderson and Stearns, 2009).Когда две клетки были обнаружены на одном и том же микрорельефе, каждая клетка занимала половину площади, и их скорость реснички соответствовала таковой у отдельных клеток на микрорельефе вдвое меньше (Fig. 3 B). Следовательно, межклеточный контакт, по-видимому, не требуется и не регулирует цилиогенез в этих клетках. До сих пор дефекты роста первичных ресничек в клетках с остановкой клеточного цикла наблюдались только в тех клетках, в которых целостность базального тела (Graser et al., 2007; Mikule et al., 2007), регуляция клеточного цикла, связанная с центросомами (Spektor et al. ., 2007) или внутрижгутиковый транспорт (Schneider et al., 2005), необходимый для цилиогенеза, специфически нарушается. Наши результаты демонстрируют сильную зависимость цилиогенеза от степени удлинения формы клеток в клетках дикого типа.
Степень распространения клеток влияет на архитектуру актиновой сети. По мере увеличения распространения клеток в клетках появлялись более крупные поперечные нервные волокна и большее количество кольцевых пучков (рис.3 А). Поскольку было показано, что динамика актина влияет на цилиогенез (Kim et al., 2010), мы проверили, участвуют ли эти структуры актина в регуляции роста первичных ресничек, связанной с формой клеток, путем нарушения целостности актиновой сети с помощью 1 мкМ цитохалазина D. Несколько крупных клеткам удалось сохранить свое распространение, тогда как их актиновая сеть была повреждена. Интересно, что после 24-часового голодания в присутствии цитохалазина D большинство клеток, независимо от их размера, было реснитчатым (рис.4 А). Кроме того, длина ресничек больше не уменьшалась в крупных клетках; вместо этого у крупных клеток были немного более длинные реснички. Актиновая сеть, следовательно, оказалась полностью ответственной за регуляцию цилиогенеза в ответ на удлинение формы клеток.
Затем мы искали более специфические структуры актина, которые могут участвовать в этой регуляции. Расположение myosin II сильно влияет на архитектуру актиновой сети и, таким образом, играет ключевую роль в установлении клеточной полярности на всех стадиях развития организма (St Johnston and Ahringer, 2010).В эпителиальных клетках эзрин ограничен апикальным полюсом, где после фосфорилирования он связывает полимеризующиеся актиновые сети в выступе мембраны с плазматической мембраной (Dard et al., 2004; Fievet et al., 2004). После 24 часов сывороточного голодания клетки RPE1, ограниченные небольшими микропаттернами, демонстрировали поляризованную актиновую сеть с миозин II-положительными актиновыми пучками на их вентральной поверхности и богатой эзрином актиновой сеткой на их дорсальной поверхности (рис. 4 B и рис. S2). . В расширенных клетках архитектура актиновой сети оказалась менее поляризованной.Окрашивание эзрином на дорсальной поверхности клетки выглядело более слабым и рассредоточенным. Большинство структур актина были сильно декорированы миозином II (Fig. 4 B and Fig. S2). В самом деле, удлинение формы клеток коррелирует с высокими уровнями сокращения актомиозина (McBeath et al., 2004; Polte et al., 2004). Поскольку было показано, что повышающая регуляция RhoA в ответ на потерю мекелина, трансмембранного белка первичных ресничек, индуцирует образование стрессовых волокон и предотвращает рост первичных ресничек (Dawe et al., 2009), высокие уровни сокращения могут быть ответственны за нарушение цилиогенеза в распространенных клетках.
Чтобы проверить эту гипотезу, сократимость клеток ингибировалась либо 10 мкМ Y27632, чтобы инактивировать киназу Rho, либо 50 мкМ блеббистатином, чтобы инактивировать АТФазу миозина II. Оба лечения индуцировали релаксацию актомиозином разросшихся клеток, что было обнаружено по значительному уменьшению окрашивания фосфомиозином II (фиг. 4B).Интересно, что доля реснитчатых клеток в расслабленных распространившихся клетках была вдвое больше, чем в контрольных распространившихся клетках в обоих случаях (Рис. 4 B). Примечательно, что не удалось обнаружить значительного влияния на среднюю длину первичных ресничек (контроль: 2,9 ± 1,5 мкм, n = 20; блеббистатин: 2,9 ± 1 мкм, n = 30; и Y27632: 3,6 ± 1 мкм, n = 30).
Чтобы еще раз подтвердить отрицательную регуляцию сокращения клеток на цилиогенез, мы высевали клетки на мягкие субстраты, чтобы ослабить сокращение клеток (Polte et al., 2004; Энглер и др., 2006; Солон и др., 2007). Клетки демонстрируют большие и прямые стрессовые волокна на твердых субстратах, но более тонкие и рыхлые пучки на мягких субстратах (рис. S2 D). Поразительно, хотя только 25% малонаселенных клеток имели первичные реснички на твердом субстрате (полистироле), почти 80% были ресничками на мягких субстратах (полиакриламидный гель; Рис. 4 C). К тому же реснички были длиннее. В целом, эти результаты продемонстрировали, что в покоящихся клетках высокий уровень сокращения, связанный с распространением клеток, затрудняет цилиогенез.
Rho-киназа, как известно, регулирует положение центросом (Chevrier et al., 2002). Т.к. ранние стадии цилиогенеза зависят от миграции базальных тел и стыковки с плазматической мембраной, мы задались вопросом, может ли архитектура актина и активность миозина II играть роль в позиционировании базальных тел. После сывороточного голодания было обнаружено, что базальное тельце мигрирует над ядром к богатой эзрином клеточной дорсальной поверхности ограниченных клеток, где они могут вырастать первичные реснички.Однако в голодных распространенных клетках базальные тельца обнаруживаются ниже ядра, в контакте с вентральной поверхностью, где они редко формируют первичные реснички (Рис. 5, A – C и Рис. S3 B). Дорсальное положение базального тела и цилиогенез, по-видимому, тесно связаны (Fig. S3 D). После обработки цитохалазином D базальные тельца заняли дорсальное положение, и цилиогенез улучшился (рис. S3, B и D). После ингибирования Rho-киназы в ограниченных клетках базальные тельца располагались ниже ядра, и цилиогенез снижался (рис.S3, B и D). Ингибирование сократимости клеток в ограниченных клетках не влияло на длину ресничек (контроль: 5 ± 1,5 мкм, n = 60; Y27632: 5,3 ± 2 мкм, n = 37; и блеббистатин: 5,1 ± 2,5 мкм, n = 34). Как ранее предполагалось на основании ингибирования RhoA в мультицилийных клетках (Park et al., 2006; Pan et al., 2007), это показало, что активность Rho киназы необходима для апикального позиционирования базального тельца и последующего роста первичной реснички. Однако в протяженных клетках ингибирование Rho киназы не влияет на вентральное положение базальных телец, но способствует росту вентральных ресничек.Это показало, что сократимость клеток действует отдельно как на расширение ресничек, так и на базальное положение тела.
В этом исследовании мы, таким образом, сообщаем о важной роли физических параметров, таких как пространственное ограничение и жесткость субстрата, которые, благодаря своему влиянию на архитектуру актинового цитоскелета, регулируют цилиогенез на выходе из клеточного цикла (Fig. 5 D). Когда отдельные клетки были достаточно пространственно ограничены на адгезивном субстрате, они могли собирать как сократительный вентральный домен, так и выступающий, богатый эзрином дорсальный домен, имитирующий апикобазальную полярность эпителиальных клеток.Эта поляризация далее передавалась во внутреннюю организацию клетки с осью ядро-центросома, ориентированной к дорсальной поверхности зависимым от Rhokinase способом. В этих условиях большинство клеток собирают первичную ресничку. Когда отдельные клетки были сильно распространены, они в основном образовывали сильно сокращенную актиновую сеть в контакте со своим адгезивным субстратом. В этом случае внутренняя полярность была обратной: ось ядро-центросома была ориентирована к вентральной поверхности. В этом положении, ниже ядра и рядом со стрессовыми волокнами, центросома не может индуцировать рост первичной реснички.Частично это было результатом локальной сократимости клеточной коры. В целом, эти результаты демонстрируют, что выхода из клеточного цикла недостаточно для индукции роста первичных ресничек. В зависимости от глобальной организации архитектуры и динамики актинового цитоскелета клетки могут входить в состояние покоя со сборкой первичной реснички или без нее. То, происходит ли такая регуляция во время развития, может иметь далеко идущие последствия, учитывая сенсорные функции первичных ресничек.
Иммортализованные теломеразой эпителиальные клетки сетчатки с пигментацией (hTERT-RPE1; Takara Bio Inc.) выращивали при 37 ° C и 5% CO 2 в DME / F12 (Invitrogen), содержащем 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 Ед / мл пенициллина и 100 Ед / мл стрептомицина. Мы использовали двойной тимидиновый блок для синхронизации клеток при переходе G1 / S. Клетки в культуральной колбе обрабатывали 5 мМ тимидином в течение 16 часов, высвобождали в течение 8 часов в нормальной культуральной среде, а затем снова обрабатывали тимидином в течение 16 часов.
Для определения встречаемости клеток, обогащенных G1, на микротекстах, клетки были обработаны трипсином сразу после митоза (10 ч после высвобождения G1 / S-синхронизации) и помещены на покровное стекло с микрорельефом (10000 клеток / см 2 ) для получения большей части узоры с отдельными ячейками.Среду осторожно промывали над клетками и через 0,5–1 ч заменяли свежей средой для удаления несвязанных клеток в суспензии. Затем через 1 час удаляли сыворотку и клетки культивировали в течение 24–72 часов.
Цитоскелетных препаратов добавляли в среду при удалении сыворотки, т. Е. Через 2 ч после посева клеток на микрорельефы. Для ингибирования киназы Rho добавляли Y27632 в концентрации 10 мкМ. Для ингибирования АТФазы миозина II добавляли блеббистатин в концентрации 50 мкМ.Для дестабилизации актиновой сети цитохалазин D добавляли в концентрации 1 мкМ через 2 часа после удаления сыворотки, чтобы позволить голодным клеткам полностью распределиться по крупным микропаттернам перед обработкой.
Для экспериментов по иммуноокрашиванию клетки помещали на покрытые полистиролом стеклянные покровные стекла для облегчения прикрепления клеток и сохранения хорошего оптического качества. Покрытие осуществляли методом центрифугирования 0,5% -ным раствором полистирола в толуоле при 3000 об / мин в течение 30 с.Слой полистирола дополнительно окислили обработкой кислородной плазмой. В качестве альтернативы клетки высевали на микрорельефные или мягкие субстраты.
Для актин-ассоциированного белка и первичного иммуноокрашивания ресничек клетки RPE1 фиксировали в 4% параформальдегиде в буфере цитоскелета, pH 6,1, в течение 15 мин при комнатной температуре без какой-либо предварительной промывки PBS. Затем их дважды промывали PBS и инкубировали в 0,1 М хлориде аммония в PBS в течение 10 мин.Затем клетки пермеабилизировали в 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 3 минут и блокировали 3% BSA в PBS в течение 30 минут. Для иммуноокрашивания фосфомиозином клетки предварительно пермеабилизировали в течение 15 с 0,1% Triton X-100 в буфере цитоскелета перед фиксацией параформальдегидом. Для обнаружения центросом клетки фиксировали в течение 5 мин в метаноле при -20 ° C. Для иммуноокрашивания Ki67 клетки фиксировали 4% параформальдегидом в PBS, pH 7,4, в течение 15 мин при комнатной температуре.
Первичные моноклональные мышиные антитела против ацетилированного тубулина (разведение 1: 10000; Sigma-Aldrich) и α-тубулина (1: 1000; AbD Serotec) и первичные поликлональные кроличьи антитела против легкой цепи фосфомиозина 2 (1: 100; Cell Signaling Technology), γ-тубулин (1: 500; Abcam) и Ki67 (1:50; Invitrogen) добавляли в блокирующем буфере (1.5% BSA) в течение 1 ч при комнатной температуре. Первичные поликлональные кроличьи антитела против фосфезрина (1: 600; Cell Signaling Technology) добавляли в блокирующий буфер в течение ночи при 4 ° C.
Вторичные антитела, конъюгированные с Cy3 и Cy5, козьими антимышиными, козьими антителами к крысам и козьими антителами против кроликов (AffiniPure; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) использовали в разведении 1: 500 в 1,5% BSA и инкубировали. с 1 мкг / мл FITC-конъюгированного фаллоидина (Sigma-Aldrich) в течение 45 мин в темноте при комнатной температуре.A «{N {> + = A» uNCD & L9a8 ؘ / = ͠ aFUYlLu) CUɠ! [U2hTu) CU5U%; d * 4 ܺ͟ W} 0 # Е = Rq + S # + e (hA = ܞ2; ܢ8 w ڶ e] Q3HK2 ֏ 2 s KMc #] 䚎
SgsWlGnL7L’Bw конечный поток эндобдж 3 0 obj > эндобдж 2 0 obj > эндобдж 4 0 obj > эндобдж 5 0 obj > поток